血細(xì)胞分析技術(shù)已經(jīng)進(jìn)入自動(dòng)化時(shí)代，而具有白細(xì)胞五分類(lèi)或更多分析參數(shù)的儀器也普遍的應(yīng)用于國(guó)內(nèi)各級(jí)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室中，為臨床診斷和治療服務(wù)。而具有18項(xiàng)參數(shù)帶有白細(xì)胞三分群功能的血細(xì)胞分析儀也已經(jīng)普及進(jìn)入到基層醫(yī)院和社區(qū)醫(yī)療中心，在許多大型醫(yī)院中已不占主流位置，因此可以說(shuō)目前在較大醫(yī)院的檢驗(yàn)科，常規(guī)血細(xì)胞分析儀已經(jīng)進(jìn)入全自動(dòng)化和白細(xì)胞五分類(lèi)的時(shí)代。
本文主要介紹全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀在白細(xì)胞五分類(lèi)上的原理和散點(diǎn)圖分布特點(diǎn)。此類(lèi)儀器在紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板和計(jì)算參數(shù)上一般會(huì)采用類(lèi)似的測(cè)定原理和計(jì)算方法，此類(lèi)儀器的進(jìn)展和其功能特點(diǎn)可參考作者撰寫(xiě)的其它文章（見(jiàn)參考文獻(xiàn)）。具有白細(xì)胞五分類(lèi)功能的血細(xì)胞分析儀器是指通過(guò)各種物理和化學(xué)技術(shù)對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行分析，以獲得外周血液中白細(xì)胞的五種常見(jiàn)類(lèi)型，嗜中性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的百分率和絕對(duì)值的測(cè)定結(jié)果，此外還應(yīng)該具有對(duì)出現(xiàn)異常白細(xì)胞的提示或初步分類(lèi)功能。
目前國(guó)內(nèi)外具有開(kāi)發(fā)研制白細(xì)胞五分類(lèi)法儀器的主要為歐美和日本生產(chǎn)廠商，比較著名的歐美廠家有Beckman-Coulter；ABBOTT；Siemens（Bayer）；ABX；日本有Sysmex和Nihon Kohdon。在國(guó)內(nèi)已經(jīng)有邁瑞（MINDRAY）公司生產(chǎn)幾個(gè)型號(hào)的五分類(lèi)血細(xì)胞分析儀器投入醫(yī)療市場(chǎng)。
一 簡(jiǎn)要發(fā)展史
1974年，一種名為HEMALOG D的具有初步白細(xì)胞分類(lèi)功能的白細(xì)胞分析儀問(wèn)世。
1982年，Technicon公司生產(chǎn)了H6000型血液細(xì)胞分析儀器，應(yīng)該是首款具有白細(xì)胞五分類(lèi)能力的儀器。同時(shí)代日本日立公司推出圖像分析法的白細(xì)胞分析儀HITACHI 8200型，僅僅是用于完成白細(xì)胞血片分類(lèi)的儀器，沒(méi)有其他血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析能力。
Technicon 公司1985 年開(kāi)發(fā)了比較成熟的具有白細(xì)胞五分類(lèi)功能的Technicon H1 型血液細(xì)胞分析儀，隨后升級(jí)為H2型和H3型。
COULTER公司在1987 年開(kāi)發(fā)研制其經(jīng)典VCS技術(shù)，并推出持續(xù)具有多年影響力的、具有白細(xì)胞五分類(lèi)功能的血液細(xì)胞分析儀MAXM 型。
1990年前后，歐洲和日本許多廠家都陸續(xù)推出了各種類(lèi)型的具有白細(xì)胞五分類(lèi)功能的血細(xì)胞分析儀器。各廠家設(shè)計(jì)生產(chǎn)的此類(lèi)血細(xì)胞分析儀，其在白細(xì)胞分類(lèi)技術(shù)上原理各不相同，分析測(cè)定項(xiàng)目略有不同，且形式多樣，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，試劑種類(lèi)和成分也趨于復(fù)雜。不斷改進(jìn)和升級(jí)的新產(chǎn)品使得儀器在白細(xì)胞分類(lèi)技術(shù)上更加成熟和可靠。而技術(shù)的提高也帶來(lái)了儀器和消耗品（試劑）價(jià)格的增加。
二 儀器原理和散點(diǎn)圖特點(diǎn)
1 體積、電導(dǎo)和激光散射原理
這是Beckman－Coulter公司生產(chǎn)的血細(xì)胞分析儀所采用的經(jīng)典分析方法，他集三種物理學(xué)檢測(cè)技術(shù)于一體，在細(xì)胞處于自然原始的狀態(tài)下對(duì)其進(jìn)行多參數(shù)分析。該方法也稱為體積、電導(dǎo)、激光散射血細(xì)胞分析法。此技術(shù)采用在標(biāo)本中首先加入紅細(xì)胞溶血?jiǎng)┤芙獾艏t細(xì)胞，然后加入穩(wěn)定劑來(lái)中和紅細(xì)胞溶解劑的作用，使白細(xì)胞表面、胞漿和細(xì)胞體積保持穩(wěn)定不變。然后應(yīng)用鞘流技術(shù)將細(xì)胞推進(jìn)到流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)池（Flowcell）中，接受儀器VCS三種技術(shù)的檢測(cè)。
V代表體積（Volume）測(cè)量法，是采用經(jīng)典的庫(kù)爾特專(zhuān)利技術(shù)，用低頻電流準(zhǔn)確分析細(xì)胞體積。體積是區(qū)分白細(xì)胞亞群的一個(gè)重要的參數(shù)，它可有效區(qū)分體積大小差異顯著的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。C代表高頻電導(dǎo)性（Conductivity），采用高頻電磁探針原理測(cè)量細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)間的差異，也是該公司的專(zhuān)利技術(shù)。細(xì)胞膜對(duì)高頻電流具有傳導(dǎo)性，當(dāng)電流通過(guò)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞核的化學(xué)組份可使電流的傳導(dǎo)性產(chǎn)生變化，其變化量可以反映出細(xì)胞內(nèi)含物的信息。該參數(shù)可用來(lái)區(qū)分體積相近而內(nèi)部性質(zhì)不同的細(xì)胞群體，如淋巴細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞，由于它們的細(xì)胞核特性不同而在傳導(dǎo)性參數(shù)上有所區(qū)別。S代表激光散射（Scatter）測(cè)量技術(shù)，采用氦氖激光源發(fā)出的單色激光掃描每個(gè)細(xì)胞，收集細(xì)胞在10°～70°角度內(nèi)出現(xiàn)的散射光 (MALS)信號(hào)。該激光束可穿透細(xì)胞，探測(cè)細(xì)胞內(nèi)核分葉狀況和胞漿中的顆粒情況，提供有關(guān)細(xì)胞顆粒性的信息，可以區(qū)分出顆粒特性不同的細(xì)胞群體。例如細(xì)胞內(nèi)顆粒粗的要比顆粒細(xì)的散射光更強(qiáng)，因此可以用于區(qū)分粒細(xì)胞中的嗜中性、嗜酸性和嗜堿性三種細(xì)胞。
圖1 VCS法的測(cè)定原理
儀器將分析每個(gè)細(xì)胞在V、C、S 三種檢測(cè)技術(shù)上的測(cè)量結(jié)果，因?yàn)椴煌?lèi)別的細(xì)胞會(huì)在體積、表面特征、內(nèi)部結(jié)構(gòu)等方面呈現(xiàn)明顯的不同。將這些特征性信息被定義到以VCS為三維坐標(biāo)(分辨率為256×256×256=16,777,216)所形成的立體散點(diǎn)圖中，這五類(lèi)細(xì)胞可在三維空間中形成特定的細(xì)胞群。通過(guò)計(jì)算某群細(xì)胞數(shù)量占白細(xì)胞總數(shù)的百分比，即可得到五項(xiàng)白細(xì)胞分類(lèi)結(jié)果。儀器不僅僅做出對(duì)正常白細(xì)胞的五項(xiàng)分類(lèi)結(jié)果，給出典型的散點(diǎn)圖型，還可以提示許多異常細(xì)胞區(qū)域的報(bào)警。
VCS技術(shù)可通過(guò)DF1、DF2、DF3三個(gè)散點(diǎn)圖將五種類(lèi)型白細(xì)胞明顯區(qū)分開(kāi)。三個(gè)散點(diǎn)圖的縱坐標(biāo)均定義為細(xì)胞體積。DF1為細(xì)胞體積和激光散射的直方圖，DF2和DF3為細(xì)胞體積和高頻電導(dǎo)性的直方圖，DF3為除去粒細(xì)胞群體后顯示出淋巴細(xì)胞后面的嗜堿性粒細(xì)胞圖像。
圖2 各類(lèi)白細(xì)胞在VCS三維空間中的分布特點(diǎn)
圖3 各類(lèi)白細(xì)胞在散點(diǎn)圖中的分布特點(diǎn)
VCS技術(shù)是Beckman－Coulter公司開(kāi)發(fā)研制的經(jīng)典專(zhuān)有方法，到目前為止的各種高檔血細(xì)胞分析儀均采用該方法對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行分析。該方法在白細(xì)胞分析上尚有特殊能力，例如可以測(cè)定和分析中性粒細(xì)胞的體積、核漿比例、細(xì)胞顆粒特性等參數(shù)，也就是將中性粒細(xì)胞的VCS三個(gè)參數(shù)分別給出，用于了解細(xì)菌感性疾病與其它疾病的區(qū)別。也可對(duì)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等均作出其細(xì)胞群體的三個(gè)技術(shù)參數(shù)值，是比較有前景的研究?jī)?nèi)容。
儀器在RBC、PLT、WBC計(jì)數(shù)上依然采用電阻抗法，血紅蛋白仍然采用比色法測(cè)定。該公司的五分類(lèi)法血細(xì)胞分析儀先后推出多種類(lèi)型，如MAXM、STKS、GEN·S、HmX、LH755和最新的LH780等型號(hào)，在某些機(jī)型還具有網(wǎng)織紅細(xì)胞分析功能和T淋巴細(xì)胞亞群分析功能。
2. 電阻抗、射頻和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)
日本Sysmex公司系列血細(xì)胞分析儀是在國(guó)內(nèi)應(yīng)用非常廣泛的儀器，從三分類(lèi)法到五分類(lèi)法的各種型號(hào)儀器都有大量用戶。其儀器型號(hào)種類(lèi)豐富，功能和測(cè)定參數(shù)各異，其各種儀器間均有近似的檢測(cè)原理，但在結(jié)合特定的功能以達(dá)到不同的分析目的方面，其原理和所用試劑又有不完全相同之處。本文以目前其最高配置的XE-2100型血細(xì)胞分析儀為例說(shuō)明其在白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類(lèi)方面的原理和特點(diǎn)。
Sysmex XE-2100在白細(xì)胞分類(lèi)上采用半導(dǎo)體激光流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)合核酸熒光染色技術(shù)進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類(lèi)。半導(dǎo)體激光照射在通過(guò)鞘流技術(shù)處理的細(xì)胞上，可根據(jù)每個(gè)細(xì)胞所產(chǎn)生的三種信號(hào)來(lái)鑒別細(xì)胞類(lèi)別。前向散射光（FSC）信號(hào)可反應(yīng)細(xì)胞體積大小；側(cè)向散射光（SSC）信號(hào)可反應(yīng)細(xì)胞的顆粒和細(xì)胞核等內(nèi)含物的信息；側(cè)向熒光（SFL）強(qiáng)度信號(hào)則用于分析細(xì)胞內(nèi)脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的含量。
在白細(xì)胞分析上主要采用兩個(gè)通道進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類(lèi)，兩個(gè)通道均采用激光和鞘流進(jìn)樣的方式測(cè)定。DIFF通道： STROMATOLYSER-4DL試劑中的表面活性劑可以溶解掉標(biāo)本中的紅細(xì)胞和血小板，并在白細(xì)胞膜上打出小孔；然后第二種試劑 STROMATOLYSER-4DS中的聚次甲基染料通過(guò)這個(gè)小孔進(jìn)入白細(xì)胞中，與細(xì)胞核的核酸和細(xì)胞器結(jié)合，在經(jīng)過(guò)波長(zhǎng)633nm的激光照射，產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞的核酸含量成正比。STROMATOLYSER -4DL試劑還具有與嗜酸性顆粒特異性結(jié)合的能力，可根據(jù)側(cè)向散射光信號(hào)強(qiáng)度，將嗜酸性粒細(xì)胞從中性粒細(xì)胞中分離出來(lái)。這樣可以將中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞清楚的分離開(kāi)。在DIFF散射圖當(dāng)中可以得到白細(xì)胞的四個(gè)分群（LMNE）。
WBC/BASO通道是專(zhuān)用作檢測(cè)嗜堿性粒細(xì)胞的通道，因?yàn)槭葔A性粒細(xì)胞數(shù)量非常少，因此必須采用特殊技術(shù)處理。STROMATOLYSER –FB是一種酸性試劑，可將紅細(xì)胞和血小板形成淡影化，將除嗜堿性粒細(xì)胞以外的白細(xì)胞處理成裸核形態(tài)，然后采用前向散射光（FSC）信號(hào)和側(cè)向散射光（SSC）信號(hào)使嗜堿性粒細(xì)胞從其它細(xì)胞中分離出來(lái)。前向散射光與細(xì)胞體積測(cè)定相關(guān)，側(cè)向散射光與裸核后的細(xì)胞結(jié)構(gòu)復(fù)雜性有關(guān)。在這個(gè)通道中可以獲得白細(xì)胞總數(shù)和嗜堿性粒細(xì)胞的數(shù)量。
圖4 Sysmex XE-2100白細(xì)胞分類(lèi)散點(diǎn)圖
儀器在幼稚粒細(xì)胞分析上有特殊的IMI通道，在IMI檢測(cè)通道中主要應(yīng)用射頻（RF）技術(shù)和直流電阻抗法（DC）。這個(gè)測(cè)定通道根據(jù)幼稚細(xì)胞膜表面比成熟細(xì)胞膜表面含有脂質(zhì)少的現(xiàn)象，在稀釋液中加入硫化氨基酸（IM試劑），由于占位不同，結(jié)合在幼稚細(xì)胞表面的氨基酸較多，對(duì)溶血?jiǎng)┯械挚棺饔茫瑢?duì)幼稚細(xì)胞具有保護(hù)作用。當(dāng)加入溶血?jiǎng)┖蟪墒旒?xì)胞易被溶解掉，而幼稚細(xì)胞不易被溶解破壞，可通過(guò)電阻法檢測(cè)出來(lái)。射頻技術(shù)用于測(cè)量細(xì)胞核的大小和顆粒的多少，而直流電信號(hào)可反應(yīng)出細(xì)胞體積的大小。
在有核紅細(xì)胞計(jì)數(shù)上通過(guò)專(zhuān)門(mén)的有核紅細(xì)胞檢測(cè)程序和專(zhuān)用通道-NRBC通道，在處理標(biāo)本時(shí)加入STROMATOLYSER－NR專(zhuān)用試劑，它能使成熟紅細(xì)胞溶解又可保持有核紅細(xì)胞的核結(jié)構(gòu)，同時(shí)也將白細(xì)胞保持完好。STROMATOLYSER－NR試劑中的聚次甲基熒光染料可滲透進(jìn)入白細(xì)胞膜內(nèi)，將白細(xì)胞和有核紅細(xì)胞的核染色。通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度得到：白細(xì)胞核大熒光強(qiáng)度高，有核紅細(xì)胞核小，熒光強(qiáng)度低，正常紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核和破碎，熒光強(qiáng)度極低。根據(jù)熒光強(qiáng)度差和前向散射光信號(hào)測(cè)定的細(xì)胞體積差，可將有核紅細(xì)胞從其他細(xì)胞群中區(qū)分出來(lái)。
圖5 Sysmex XE-2100 的幼稚細(xì)胞通道和有核紅細(xì)胞通道散點(diǎn)圖
該儀器在紅細(xì)胞和血小板的計(jì)數(shù)和分析上仍然沿用了經(jīng)典的電阻抗方法，在血紅蛋白測(cè)定上采用了無(wú)劇毒物質(zhì)的SLS溶血?jiǎng)┍壬ā?/p>
3 激光散射和細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)
最早采用該技術(shù)的是Technicon公司的H1,H3型，現(xiàn)在的最新型為西門(mén)子公司的Advia120型和2120型（2007年以前為Bayer公司產(chǎn)品）。他是一款開(kāi)發(fā)比較早的高等級(jí)儀器，其在白細(xì)胞分類(lèi)上采用了過(guò)氧化酶測(cè)定通道和嗜堿粒細(xì)胞測(cè)定通道。根據(jù)細(xì)胞化學(xué)染色的特性進(jìn)行白細(xì)胞分類(lèi)。在紅細(xì)胞和血小板分析都采用了雙角度激光法。在儀器的管路、電磁閥門(mén)、反應(yīng)杯上采用了獨(dú)特設(shè)計(jì)的集成液流版管路系統(tǒng)，是目前血細(xì)胞分析儀中所獨(dú)有和特有的技術(shù)。
集成液流板實(shí)際上是將各種管路和電磁閥門(mén)、反應(yīng)杯等血球計(jì)數(shù)儀的常用硬件進(jìn)行綜合處理，系統(tǒng)化，微小化，透明化和集成化。形成的集成板被放置在儀器的明顯部位，方便觀察，并具一定的美觀效果。其另一特點(diǎn)則是細(xì)小的管路和反應(yīng)杯可是標(biāo)本和試劑用量明顯減少。
圖6 Advia 120的集成液流板。
在白細(xì)胞分類(lèi)上，該儀器采用兩個(gè)通道進(jìn)行，一個(gè)為過(guò)氧化酶檢測(cè)通道，另一個(gè)為嗜堿細(xì)胞檢測(cè)通道。
過(guò)氧化酶反應(yīng)（peroxidase，POX）是血涂片染色的一個(gè)常用細(xì)胞化學(xué)染色方法，用于鑒別原始細(xì)胞與成熟的粒細(xì)胞，鑒別粒細(xì)胞與非粒細(xì)胞。染色后的細(xì)胞內(nèi)無(wú)藍(lán)黑色顆粒出現(xiàn)為陰性反應(yīng)，出現(xiàn)細(xì)小顆?；蛳∈铇臃植嫉暮谏w粒為弱陽(yáng)性反應(yīng)，出現(xiàn)黑色粗大而密集的顆粒為強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。過(guò)氧化物酶主要存在于粒細(xì)胞系和單核細(xì)胞系中，各類(lèi)白細(xì)胞對(duì)過(guò)氧化物酶的反應(yīng)是這樣的：早期的原始粒細(xì)胞為陰性，早幼粒以后的各階段都含有過(guò)氧化物酶，并隨著細(xì)胞的成熟過(guò)氧化酶含量逐漸增強(qiáng)，中性分葉核粒細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，嗜酸性粒細(xì)胞具有最強(qiáng)的過(guò)氧化物酶反應(yīng)，嗜堿粒細(xì)胞不含此酶呈陰性反應(yīng)。在單核細(xì)胞系統(tǒng)，除早期原始階段外，幼稚單核和單核細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)較弱的過(guò)氧化物酶反應(yīng)。淋巴細(xì)胞、幼稚紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞等都為過(guò)氧化物酶陰性反應(yīng)。Advia 120/2120血細(xì)胞分析儀的過(guò)氧化酶（Perox）檢測(cè)通道就是根據(jù)這個(gè)原理設(shè)計(jì)的，它檢測(cè)每一個(gè)通過(guò)流動(dòng)計(jì)數(shù)池中的白細(xì)胞，經(jīng)過(guò)激光照射所產(chǎn)生的過(guò)氧化酶散射光吸收率，來(lái)當(dāng)然試劑和輔助試劑均進(jìn)行了改良。
在Perox通道所產(chǎn)生的散點(diǎn)圖，橫軸表示在5°-15°激光散射獲得的細(xì)胞過(guò)氧化物酶含量情況，縱軸是低角度散射光測(cè)量的細(xì)胞體積大小。在此通道內(nèi)細(xì)胞被分為五類(lèi)。1）過(guò)氧化酶最強(qiáng)陽(yáng)性的嗜酸性粒細(xì)胞；2）過(guò)氧化酶強(qiáng)陽(yáng)性的嗜中性分葉核粒細(xì)胞；3）體積較大、過(guò)氧化酶弱陽(yáng)性的單核細(xì)胞；4）體積較小、過(guò)氧化物酶陰性的淋巴細(xì)胞；5)體積大于淋巴細(xì)胞且過(guò)氧化物酶陰性的未染色大細(xì)胞，此類(lèi)細(xì)胞增加提示幼稚或原始的各類(lèi)細(xì)胞可能出現(xiàn)。
在嗜堿細(xì)胞（Baso）通道中采用的檢測(cè)原理是：專(zhuān)用的嗜堿細(xì)胞試劑（Baso）將除了嗜堿細(xì)胞以外的白細(xì)胞除去細(xì)胞膜，使其裸核化并體積變小，僅將嗜堿性粒細(xì)胞保持原有狀態(tài)，體積明顯大于其他類(lèi)的白細(xì)胞。在散點(diǎn)圖上處于上面區(qū)域的為嗜堿性粒細(xì)胞；散點(diǎn)圖的橫坐標(biāo)可表示細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，處于左側(cè)的為單個(gè)核的細(xì)胞群，包括單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞；處于右側(cè)的為分葉核細(xì)胞；中間部位則考慮為桿狀核細(xì)胞；左下端為單個(gè)核的原始細(xì)胞區(qū)。
圖7：ADVIA 120/2120儀器Perox通道和Baso通道散點(diǎn)圖
該儀器在紅細(xì)胞、血小板的測(cè)定上也采用了光學(xué)檢測(cè)技術(shù)。通過(guò)激光照射掃描每個(gè)通過(guò)Flowcell的紅細(xì)胞，低角度散射光（2 °~3 °）用于測(cè)量細(xì)胞體積；高角度(5°～15°)散射光測(cè)量每個(gè)紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白濃度（CH）和血紅蛋白含量平均值CHCM。這兩個(gè)值不受紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白測(cè)定的影響。還可根據(jù)每個(gè)紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白濃度，計(jì)算出紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白分布寬度（HDW）值。其根據(jù)紅細(xì)胞在體積大小和單個(gè)紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白含量的分析，將紅細(xì)胞劃分為9個(gè)區(qū)域，得到紅細(xì)胞體積和色素含量分布的九分圖，也是該儀器在紅細(xì)胞分析方面獨(dú)有的特色，根據(jù)紅細(xì)胞分布情況可初步判斷疾病類(lèi)別（下圖中）。在血小板計(jì)數(shù)分析上也同樣采用了二維光散射分析法，即可獲得血小板體積大小，可測(cè)量1~60fl內(nèi)的各種大小不同的血小板，還可對(duì)血小板內(nèi)容物含量（MPC）進(jìn)行測(cè)定。血紅蛋白測(cè)定采用連續(xù)流動(dòng)比色法和紅細(xì)胞散射光直接測(cè)定法兩種方法，有助于高脂血和高膽紅素血標(biāo)本的血紅蛋白測(cè)定準(zhǔn)確性。
圖8：ADVIA 120/2120 紅細(xì)胞散點(diǎn)圖
4 雙鞘流技術(shù)和細(xì)胞化學(xué)染色法
ABX是法國(guó)生成血細(xì)胞分析儀器的著名廠家，其生產(chǎn)的全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀Pentra 120型為其高端產(chǎn)品。在白細(xì)胞分類(lèi)上采用該公司特有的專(zhuān)利技術(shù)-雙鞘流（DHSS）分析法。雙鞘流是專(zhuān)利技術(shù)，而測(cè)定本身是通過(guò)電阻抗和光吸收法雙重原理。標(biāo)本首先在第一鞘流液中經(jīng)過(guò)電阻抗測(cè)定分析，得到細(xì)胞體積測(cè)定結(jié)果，然后通過(guò)第二鞘流引導(dǎo)再行光吸收率分析，對(duì)細(xì)胞內(nèi)容物進(jìn)行測(cè)定，最終將細(xì)胞測(cè)定信息在散射圖相應(yīng)的位置表現(xiàn)出來(lái)。雙鞘流技術(shù)的核心部件是含有紅寶石小孔的復(fù)雜的鞘流池，在雙鞘流系統(tǒng)的上下兩端分別加上恒定電流，是保證電阻法的測(cè)量要素。為了保證被檢測(cè)的細(xì)胞能夠正確通過(guò)計(jì)數(shù)孔和鞘流通道，需要利用外來(lái)鞘流來(lái)進(jìn)行矯正，因此通過(guò)左側(cè)鞘流泵注入稀釋液形成第一鞘流液，其作用是保護(hù)溶液能夠直接通過(guò)計(jì)數(shù)小孔，并且保證其中攜帶的細(xì)胞處于中心部位，液流不發(fā)生偏移和扭曲；溶液通過(guò)計(jì)數(shù)小孔后，再通過(guò)中間鞘流泵注入稀釋液形成第二股鞘流，用以保證吸光度測(cè)量。這樣的過(guò)程被稱為雙鞘流分析技術(shù)。
圖9 雙鞘流技術(shù)示意圖
儀器通過(guò)兩個(gè)通道來(lái)完成白細(xì)胞的五項(xiàng)分類(lèi)。其采用的細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)（Cytochemistry）的原理是經(jīng)典的細(xì)胞分類(lèi)技術(shù)，此染色劑中含有溶血素及氯唑黑活體染料（Chlorazol Black E）。在儀器的LMNE檢測(cè)池中，全血樣品與染色劑充分混勻，在35℃條件下進(jìn)行孵育，此過(guò)程的作用是：① 溶解紅細(xì)胞 ②對(duì)單核細(xì)胞的初級(jí)顆粒、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的特異顆粒進(jìn)行不同程度的染色，同時(shí)對(duì)細(xì)胞的膜（細(xì)胞膜、核膜、顆粒膜）也進(jìn)行不同程度的著色 ③ 固定細(xì)胞的形態(tài)，使其保持自然狀態(tài)。由于淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞對(duì)染色劑的著色程度不同、每種細(xì)胞特定的細(xì)胞核形態(tài)和顆粒的結(jié)構(gòu)造成光散射的強(qiáng)度不同，產(chǎn)生了特定的吸光率。
染色后的標(biāo)本被引導(dǎo)進(jìn)入鞘流池進(jìn)行雙鞘流分析，首先經(jīng)過(guò)60mm紅寶石小孔進(jìn)行電阻法分析，用于判斷細(xì)胞體積大小，在LMNE散點(diǎn)圖上的橫坐標(biāo)即可表示出細(xì)胞大小的特性。然后樣本迅速進(jìn)入直徑為42mm的第二鞘流檢測(cè)通道進(jìn)行光吸收率測(cè)定，以判斷細(xì)胞形態(tài)和內(nèi)容物等情況。根據(jù)每類(lèi)細(xì)胞在這兩個(gè)分析參數(shù)上所表現(xiàn)出來(lái)的特性，形成二維分布的散點(diǎn)圖。在此通道內(nèi)可完成白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸細(xì)胞群的分類(lèi)。此通道內(nèi)在分析的同時(shí)還能夠檢測(cè)兩群異常白細(xì)胞亞群：巨大未成熟細(xì)胞（LIC）百分比及絕對(duì)值，異型淋巴細(xì)胞（ALY）百分比及絕對(duì)值，同時(shí)還可提供多達(dá)82種提示和報(bào)警信息。
在LMNE散點(diǎn)圖上，各類(lèi)白細(xì)胞的特點(diǎn)是：①淋巴細(xì)胞：典型的淋巴細(xì)胞體積較小、形態(tài)規(guī)則、胞漿內(nèi)沒(méi)有顆粒，其吸光率最低，所以定位在散點(diǎn)圖的右下部矩陣中，正常淋巴細(xì)胞散點(diǎn)圖為正態(tài)體積分布。②單核細(xì)胞：典型的單核細(xì)胞體積較大、腎狀核、胞漿內(nèi)有初級(jí)顆粒（幾乎不著色），細(xì)胞核大且不分葉，光散射較少，所以位于吸光率軸的最下端，依據(jù)單核細(xì)胞的體積，位于體積軸的最右端，而異常單核細(xì)胞及特大單核細(xì)胞則可能出現(xiàn)在LIC的矩陣中。③中性粒細(xì)胞：典型的中性粒細(xì)胞具有嗜中性顆粒及分葉核的結(jié)構(gòu)，中性顆粒部分著色，同時(shí)由于顆粒及核的分葉等形態(tài)上的復(fù)雜性，而產(chǎn)生光散射。所以中性粒細(xì)胞群散點(diǎn)圖位于中部。核分葉越多的中性粒細(xì)胞，吸光性越強(qiáng)，在散點(diǎn)圖上的位置向右移。同時(shí)桿狀細(xì)胞（Bands）體積與中性粒細(xì)胞接近，但核的復(fù)雜程度低，吸光率低，散點(diǎn)圖位于中性粒細(xì)胞與單核細(xì)胞之間。④嗜酸性粒細(xì)胞：由于嗜酸性粒細(xì)胞含有特異性顆粒，與染色液特異性著色，其著色強(qiáng)度最深，位于Y-軸的最上端，此方法提高了嗜酸性粒細(xì)胞的分類(lèi)的準(zhǔn)確性。⑤巨大未成熟細(xì)胞（Large Immature Cell）：未成熟粒細(xì)胞因其體積較大，可含有顆粒，光散射強(qiáng)，位于嗜中性粒細(xì)胞散點(diǎn)圖的右側(cè)，在LIC矩陣圖中從左到右依次排列晚幼粒、中幼粒、早幼粒細(xì)胞，另外各種原始細(xì)胞位于單核細(xì)胞的右側(cè)區(qū)域中。由于此散點(diǎn)圖中可能有大單核細(xì)胞，可引起LIC假性計(jì)數(shù)增加（LIC的計(jì)數(shù)結(jié)果被計(jì)算到在嗜中性粒細(xì)胞中）。LIC包括：大單核細(xì)胞、高嗜堿性的單核細(xì)胞、巨大中性粒細(xì)胞、早幼粒細(xì)胞、中幼粒細(xì)胞、晚幼粒細(xì)胞、原始細(xì)胞。⑥異型淋巴細(xì)胞(Atypical Lymphs)：在散點(diǎn)圖中位于淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞之間的一群細(xì)胞，包括：小原始粒細(xì)胞、大淋巴細(xì)胞等。
在WBC/BASO檢測(cè)池中，全血樣品與BasolyseII（PH2.4）溶血素混合，在35°C恒溫下，溶解紅細(xì)胞，由于嗜堿性粒細(xì)胞具有抗酸性，能夠保持形態(tài)完整，而其他白細(xì)胞胞漿溢出，成為裸核狀態(tài)。細(xì)胞通過(guò)一個(gè)直徑為80mm的鞘流微孔時(shí)，根據(jù)電阻抗原理進(jìn)行測(cè)定，以細(xì)胞體積大小為橫坐標(biāo)繪制WBC/BASO直方圖。依據(jù)閾值設(shè)定區(qū)分裸核化的白細(xì)胞與嗜堿性粒細(xì)胞。在直方圖上可以看出在中心界標(biāo)左側(cè)的是細(xì)胞體積變小的其它細(xì)胞群，界標(biāo)右側(cè)是體積較大的嗜堿性粒細(xì)胞。因嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)量極少，因此在直方圖上基本見(jiàn)不到明顯分布曲線和峰。
圖10 ABX血細(xì)胞分析儀LMNE散點(diǎn)圖和BASO直方圖
紅細(xì)胞和血小板仍然采用電阻抗原理測(cè)定，血紅蛋白采用比色法。此為在軟件系統(tǒng)中采用了浮動(dòng)界標(biāo)技術(shù)用于血小板計(jì)數(shù)及嗜堿細(xì)胞計(jì)數(shù)，直方圖的界標(biāo)會(huì)依據(jù)細(xì)胞群的變化做出相應(yīng)的自動(dòng)調(diào)整。血小板計(jì)數(shù)上還采用了防返流裝置，目的為防止渦流現(xiàn)象對(duì)血小板計(jì)數(shù)產(chǎn)生影響。在白細(xì)胞計(jì)數(shù)過(guò)程中還采用了白細(xì)胞平衡檢測(cè)原理（WBC Count Balance），使得白細(xì)胞計(jì)數(shù)在WBC/HGB通道中與LMNE雙鞘流池計(jì)數(shù)結(jié)果相聯(lián)系，如果出現(xiàn)較大差別則可進(jìn)行報(bào)警提示。
最近該廠推出新一代ABX Pentra DX120型血細(xì)胞分析儀，其測(cè)定原理仍然采用雙鞘流技術(shù)。采用新技術(shù)擴(kuò)展了散點(diǎn)圖分布范圍，形成可對(duì)血液中未成熟的粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞共20個(gè)參數(shù)的分類(lèi)或提示性報(bào)告信息，這對(duì)異常血細(xì)胞的篩檢提供了很大幫助。
圖11 Pentra DX120型幼稚細(xì)胞散點(diǎn)圖
5 多角度偏振光激光散射技術(shù)
美國(guó)雅培公司（ABBOTT）推出的血細(xì)胞分析儀，在白細(xì)胞分類(lèi)中采用獨(dú)特的多角度偏振光散射（MAPSS）技術(shù)，其所生產(chǎn)的血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀從CELL-DYN 3000，3200，3500，3700，4000，以及Sapphire（藍(lán)寶石），在白細(xì)胞分類(lèi)上均采用了MAPSS技術(shù)。該技術(shù)基本原理是細(xì)胞在激光束的照射下，在多個(gè)角度都產(chǎn)生散射光，儀器在四個(gè)角度的四個(gè)檢測(cè)器將接收到的相應(yīng)的散射光信號(hào)，然后經(jīng)過(guò)微處理器分析處理，將各類(lèi)細(xì)胞安置在散點(diǎn)圖上的相應(yīng)位置，并計(jì)算出白細(xì)胞分類(lèi)結(jié)果。
多角度偏振光散射白細(xì)胞分類(lèi)技術(shù)（Multi—Angle Polatised Scatter Separation of white cell，MAPSS）其原理是一定體積的全血標(biāo)本用鞘流液按適當(dāng)比例稀釋。其白細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)近似于自然狀態(tài)，因嗜堿性粒細(xì)胞顆粒具有吸濕的特性，所以嗜堿性粒細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有輕微改變。紅細(xì)胞內(nèi)部的滲透壓高于鞘液滲透壓而發(fā)生改變，紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白從細(xì)胞內(nèi)游離出來(lái)，而鞘液內(nèi)的水分進(jìn)入紅細(xì)胞中，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)仍然完整，但此時(shí)的紅細(xì)胞折光指數(shù)與鞘液的相同，故紅細(xì)胞不干擾白細(xì)胞檢測(cè)。在鞘流系統(tǒng)的作用下，樣本被集中為一個(gè)直徑30μm的小股液流，該液流將稀釋的血細(xì)胞單個(gè)排列，然后通過(guò)激光束，激光照射于細(xì)胞上，在各個(gè)方向都有其散射光出現(xiàn)。0°為前向角散射（1°～3°）光，可粗略地測(cè)定細(xì)胞大小；②10°為狹角散射光（7°～11°），可測(cè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其復(fù)雜性的相對(duì)特征；③90°為消偏振光散射（70°`～110°），基于顆?？梢詫⒋怪苯嵌鹊钠窦す庀竦奶匦裕瑢⑹人峒?xì)胞從中性粒細(xì)胞和其它細(xì)胞中分離出來(lái)。④90°垂直光散射（70°～110°），主要對(duì)細(xì)胞內(nèi)部顆粒和細(xì)胞成分進(jìn)行測(cè)量。這四個(gè)角度同時(shí)對(duì)單個(gè)白細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量和分析后，即可將白細(xì)胞劃分為嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞5種。ABBOTT的五分類(lèi)法定量很有意思，不用傳統(tǒng)的體積定量，而是采用數(shù)量定量，每次計(jì)數(shù)時(shí)完成10000個(gè)細(xì)胞測(cè)定即停止。
圖12 MAPSS測(cè)定原理示意圖
該類(lèi)型儀器除了基本的白細(xì)胞五分類(lèi)外，還提供了其它異常白細(xì)胞的信息和報(bào)警，提供給檢驗(yàn)者參考，以通過(guò)人工顯微鏡檢查復(fù)核這些結(jié)果，例如異常淋巴細(xì)胞、原始細(xì)胞、未成熟粒細(xì)胞、桿狀核中性粒細(xì)胞。
圖13 ABBOTT CELL-DYN五分類(lèi)血細(xì)胞分析儀各類(lèi)白細(xì)胞在散射圖上的分布圖
6 激光散射技術(shù)
日本光電公司是開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)五分類(lèi)血細(xì)胞分析儀的廠家之一，目前所知僅有兩款類(lèi)型的儀器投入市場(chǎng)，均采用相同的測(cè)定原理，型號(hào)是MEK-7222和MEK-8222。其WBC、RBC和PLT計(jì)數(shù)原理采用電阻法，白細(xì)胞分類(lèi)測(cè)定采用鞘流技術(shù)和激光散射原理。在鞘流液中白細(xì)胞通過(guò)管路進(jìn)入鞘流池內(nèi)，激光照射白細(xì)胞后發(fā)生的各種散射光，根據(jù)血細(xì)胞的體積、血細(xì)胞的復(fù)雜性（有無(wú)顆粒、核的構(gòu)造等）的不同，散射光的強(qiáng)度和方向有所不同。激光直進(jìn)方向和同方向小角度的散射光（表示Size）、激光直進(jìn)方向和同方向大角度的散射光（表示Complexity）、與激光直進(jìn)方向相對(duì)垂直的方向的散射光（表示Granularity）為參數(shù)的作為散點(diǎn)圖，對(duì)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)。Size表示血細(xì)胞的大小、Complexity表示白細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)雜度、Granularity表示白細(xì)胞顆粒的程度。采用此原理可提供了三個(gè)散射圖，MAIN散點(diǎn)圖、 NE-EO散點(diǎn)圖 和MO-BA散點(diǎn)圖。在MAIN散點(diǎn)圖上（大圖部分）下面散點(diǎn)表示淋巴細(xì)胞群，右側(cè)為粒細(xì)胞群；兩個(gè)小圖，NE-EO為中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞散點(diǎn)圖，MO-BA為單核細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞細(xì)胞散點(diǎn)圖。此外儀器還能給出大的不成熟細(xì)胞（LIC）提示信息。
圖14 日本光電MEK7222型五分類(lèi)血細(xì)胞分析儀散點(diǎn)圖
7 邁瑞激光散射和細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)
邁瑞（MINDRAY）公司是國(guó)內(nèi)最早有能力生產(chǎn)五分類(lèi)血細(xì)胞分析儀的廠家，他們目前生產(chǎn)有三種型號(hào)的五分類(lèi)血細(xì)胞分析儀。BC-5500，BC5380和BC5300型自動(dòng)五分類(lèi)血液細(xì)胞分析儀，采用半導(dǎo)體激光散射技術(shù)和細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)，配合改良的流式分析裝置對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行精確的五分類(lèi)分析。BC-5500型為目前最高配置，可選擇使用靜脈血或預(yù)稀釋末梢血，均能獲得良好的各種細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果和白細(xì)胞五分類(lèi)結(jié)果。可提供27項(xiàng)計(jì)數(shù)和計(jì)算參數(shù)、2個(gè)散點(diǎn)圖和2個(gè)直方圖以及異常報(bào)警信息。測(cè)定速度為80個(gè)標(biāo)本/小時(shí)（配自動(dòng)進(jìn)樣器），全中文的操作界面，操作及提示功能一目了然，具有大型彩色TFT觸摸屏，操作簡(jiǎn)單方便。
鞘流技術(shù)是所有高檔血細(xì)胞分析儀均采用的細(xì)胞進(jìn)樣技術(shù)，為了達(dá)到更高的液流速度壓力差和更穩(wěn)定的液體流動(dòng)，該公司獨(dú)創(chuàng)性地采用了二次加速鞘流技術(shù)，分級(jí)實(shí)現(xiàn)鞘液的第二次加速，增加了單位時(shí)間內(nèi)細(xì)胞的通過(guò)流量，從而能夠完成對(duì)預(yù)稀釋血液進(jìn)行白細(xì)胞五分類(lèi)分析。
儀器通過(guò)兩個(gè)通道完成白細(xì)胞分類(lèi)測(cè)定。在DIFF通道中增加了利用了可對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞進(jìn)行染色的特殊試劑。激光散射分析技術(shù)是五分類(lèi)法常用的分析技術(shù)，由于細(xì)胞的物理特性，當(dāng)激光照射到細(xì)胞時(shí)，會(huì)有不同角度的散射光出現(xiàn)。低角度(1°~5°)散射光可反映細(xì)胞體積大小信息；中高角度(10°~20°)散射光可反映細(xì)胞顆粒的復(fù)雜性信息。綜合這兩個(gè)角度散射光的信息，結(jié)合其他特殊技術(shù)來(lái)完成白細(xì)胞的五分類(lèi)測(cè)定。標(biāo)本在鞘流的帶動(dòng)下進(jìn)入儀器的檢測(cè)區(qū)域后，激光照射于細(xì)胞之上所發(fā)射出的低角度和中高角度散射光信號(hào)可表現(xiàn)出細(xì)胞大小和內(nèi)容物復(fù)雜程度（包括細(xì)胞內(nèi)顆粒等）的特性信息，經(jīng)儀器檢測(cè)分析，將其分布在一個(gè)二維空間的散點(diǎn)圖中，可區(qū)分淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。而化學(xué)染色技術(shù)可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞的準(zhǔn)確判定。
在WBC/BASO通道中通過(guò)強(qiáng)溶型試劑和特異性染色技術(shù)，可保留完整的嗜堿性粒細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行特異性修飾，同時(shí)破壞其它四類(lèi)白細(xì)胞，使之形成膜包核狀態(tài)，在激光的照射下同樣形成兩個(gè)角度的散射光，完整的嗜堿性粒細(xì)胞體積偏大，其他類(lèi)別白細(xì)胞體積變小，通過(guò)激光信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)計(jì)數(shù)嗜堿性粒細(xì)胞并在該通道中計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù)。該方法可以有效排除難溶性紅細(xì)胞、巨大血小板、血小板聚集及其它非細(xì)胞顆粒等因素對(duì)計(jì)數(shù)的影響，保證嗜堿性粒細(xì)胞及WBC總數(shù)的精確分類(lèi)和計(jì)數(shù)。
圖15 邁瑞五分類(lèi)血細(xì)胞分析儀散點(diǎn)圖特征
三 圖像分析法白細(xì)胞分類(lèi)儀器
文章開(kāi)始部分已經(jīng)提到在1982年日本日立公司生產(chǎn)的8200型白細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)，應(yīng)該是此類(lèi)儀器的原始機(jī)型。而作者在1984年也曾經(jīng)參與過(guò)中科院某研究所的一個(gè)關(guān)于血細(xì)胞形態(tài)特征數(shù)字化的研究工作，其目的是將5類(lèi)白細(xì)胞基本信息在顯微鏡下掃描后形成數(shù)據(jù)模型，可惜這項(xiàng)工作因?yàn)楫?dāng)時(shí)技術(shù)條件的限制而沒(méi)有取得預(yù)想的結(jié)果。
近年來(lái)瑞典CellaVision AB公司開(kāi)發(fā)出一種新型自動(dòng)影像血細(xì)胞形態(tài)分析系統(tǒng)CellaVision已經(jīng)投入臨床應(yīng)用，該產(chǎn)品2005年3月在歐洲開(kāi)始投放市場(chǎng),已經(jīng)有許多實(shí)驗(yàn)室配備了該系統(tǒng)，用于進(jìn)行血涂片的過(guò)篩檢查，該產(chǎn)品2007年進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)，正處于推廣中。該系統(tǒng)目前有兩款機(jī)型，CellaVision DM96和CellaVision DM8。該系統(tǒng)是以染色后的血涂片為標(biāo)本，以最接近傳統(tǒng)顯微鏡觀察法的技術(shù)對(duì)血液中的白細(xì)胞、紅細(xì)胞進(jìn)行初步分類(lèi)的儀器，該儀器采用先進(jìn)的人工智能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)和全自動(dòng)的操作程序，可使血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)在自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化、智能化方面達(dá)到一定的目的和水準(zhǔn)，在強(qiáng)調(diào)形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)重要性的背景下有良好的發(fā)展前景。
圖 16 檢驗(yàn)醫(yī)師在Cellavision顯示屏前審查白細(xì)胞分類(lèi)結(jié)果
該儀器的組成可分為五大部分
1 血片自動(dòng)傳輸系統(tǒng) 將染色后的標(biāo)準(zhǔn)血涂片放在片盒內(nèi)。該系統(tǒng)不具染色功能，需先將血片用瑞氏或瑞氏-姬姆薩染液染色。血片可按照順序被儀器傳輸系統(tǒng)傳送到顯微鏡載物臺(tái)上。
2 血片自動(dòng)傳輸系統(tǒng) 將血片從片盒內(nèi)取出并通過(guò)掃描條碼記錄標(biāo)本編號(hào)，然后將標(biāo)本送到自動(dòng)顯微鏡的載物臺(tái)上。
3 自動(dòng)加油系統(tǒng) 自動(dòng)吸取適量的顯微鏡油，滴加到血涂片適當(dāng)?shù)奈恢?，用于油鏡頭下的細(xì)胞觀察和分類(lèi)。其感應(yīng)器能提示加油的狀態(tài)和加油的量。
4 自動(dòng)血涂片掃描系統(tǒng) 包括一臺(tái)具有物鏡頭自動(dòng)轉(zhuǎn)換、血涂片可三維方向移動(dòng)的自動(dòng)顯微鏡和一臺(tái)具有自動(dòng)調(diào)焦能力的數(shù)碼照相機(jī)。物鏡頭可根據(jù)要求自動(dòng)轉(zhuǎn)換×10、×40、×100倍鏡頭；載物臺(tái)可水平上下左右移動(dòng)，并可按照Z(yǔ)字型路線移動(dòng)血片，供照相機(jī)攝取不同部位的細(xì)胞形態(tài)圖像。
5 數(shù)據(jù)光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng) 數(shù)碼相機(jī)拍攝后的數(shù)字圖像信息，將光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變成數(shù)字信號(hào)，然后對(duì)每個(gè)視野下的圖像進(jìn)行分析，辨識(shí)單細(xì)胞層，白細(xì)胞定位點(diǎn)，從而為軟件系統(tǒng)的白細(xì)胞分類(lèi)提供源數(shù)據(jù)。
儀器分析原理：首先在×10倍物鏡頭下搜索單細(xì)胞層，轉(zhuǎn)換×40倍物鏡頭后拍攝紅細(xì)胞圖像，再轉(zhuǎn)換×100倍油鏡頭后，在鏡油加入后，在單細(xì)胞層掃描拍攝有核的白細(xì)胞，其所搜尋拍攝的白細(xì)胞數(shù)量可自行定義。獲得細(xì)胞數(shù)碼圖像后，通過(guò)軟件系統(tǒng)提取細(xì)胞特征，例如紅細(xì)胞，需提取紅細(xì)胞直徑、顏色、色素含量、對(duì)比度等特征性信息；白細(xì)胞需提取白細(xì)胞形狀、大小、紋理、顏色、空隙、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)比例關(guān)系等360個(gè)信息參數(shù)。將所提取的特征信息轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，然后通過(guò)人工智能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)（ANN）進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。這種人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)是根據(jù)大型細(xì)胞數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行制作的。
圖17 Cellavision拍攝的中性粒細(xì)胞圖片
圖18 Cellavision拍攝的中性桿狀核粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和幼稚細(xì)胞圖片
儀器顯示屏上可提供白細(xì)胞分類(lèi)的結(jié)果和分割成單細(xì)胞的圖片，在一般情況下操作者只需要確認(rèn)分類(lèi)結(jié)果，以及側(cè)重于那些處于邊緣的細(xì)胞分類(lèi)即可。對(duì)儀器不能確認(rèn)的細(xì)胞，可通過(guò)屏幕調(diào)出，放大觀察，再確認(rèn)類(lèi)別。操作者還可建立自己的參考細(xì)胞圖庫(kù)，并可對(duì)細(xì)胞形態(tài)和報(bào)告添加備注。系統(tǒng)還可與血細(xì)胞分析儀連接，獲取血細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果，形成血細(xì)胞自動(dòng)化分析 形態(tài)學(xué)報(bào)告的更加完美的結(jié)果。該系統(tǒng)可給出白細(xì)胞17個(gè)類(lèi)別，除了五分類(lèi)結(jié)果外，還有早幼粒細(xì)胞、晚幼粒細(xì)胞、原始細(xì)胞、異型淋巴細(xì)胞等類(lèi)別；紅細(xì)胞分析上可得到大小不均、小型紅細(xì)胞、巨紅細(xì)胞、低色素紅細(xì)胞、多色性紅細(xì)胞、異型紅細(xì)胞等信息；在血小板上可觀察到血小板聚集情況，以及根據(jù)圖像中血小板數(shù)量判斷核實(shí)血小板數(shù)量，與血細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)的血小板數(shù)量相互比對(duì)核實(shí)。可形成帶有白細(xì)胞分類(lèi)圖的結(jié)果報(bào)告。
儀器涂片和染色可通過(guò)手工方式操作，但需要較好的技術(shù)水平，薄血片，并有一定數(shù)量的單細(xì)胞層，染色顏色保持穩(wěn)定。也可配置自動(dòng)涂片和自動(dòng)染色機(jī)完成血涂片的前期預(yù)備性工作。該儀器可與全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行連接，可以將具有形態(tài)學(xué)特點(diǎn)的分類(lèi)結(jié)果與儀器分析結(jié)果進(jìn)行合并，得到更加可靠的血細(xì)胞分析數(shù)據(jù)。
小結(jié)：本文從全自動(dòng)五分類(lèi)式血細(xì)胞分析儀談起，主要介紹各種品牌和代表類(lèi)型的儀器在白細(xì)胞分析和分類(lèi)上的不同原理和散點(diǎn)圖特征，這些儀器應(yīng)該是目前國(guó)內(nèi)在應(yīng)用五分類(lèi)血細(xì)胞分析儀上有代表性的儀器。文中材料來(lái)自教材、圖書(shū)、文獻(xiàn)報(bào)道和廠家宣傳資料。如有不妥或錯(cuò)誤請(qǐng)大家指正。